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LNCRNA DLGAP1-AS2调节miR-503 / cyclin d1,以促进非小细胞肺癌中的细胞增殖

抽象的

背景

LNCRNA DLGAP1-AS2在胶质瘤中起着致癌作用,而其在其他癌症中的作用是未知的。本研究旨在研究DLGAP1-AS2在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用。

方法

通过5年随访研究,分析64例非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌和配对非肿瘤组织中DLGAP1-AS2的表达以及DLGAP1-AS2对非小细胞肺癌的预后价值。DLGAP1-AS2和miR-503之间的相互作用通过双荧光素酶报告分析得到证实,并在转染DLGAP1-AS2表达载体或miR-503模拟物的NSCLC细胞中探讨了它们之间的关系。通过RT-qPCR和Western blot分析DLGAP1-AS2和miR-503在调节细胞周期蛋白D1表达中的作用。CCK-8法检测细胞增殖。

结果

DLGAP1-AS2在非小细胞肺癌中上调,预测生存率低。DLGAP1-AS2和miR-503之间的相互作用通过双荧光素酶活性测定得到证实。过度表达实验表明DLGAP1-AS2和miR-503过度表达不能显著影响彼此的表达。有趣的是,DLGAP1-AS2过表达上调了细胞周期蛋白D1(miR-503的靶点),增加了细胞增殖,并降低了miR-503过表达对细胞周期蛋白D1表达和细胞增殖的影响。

结论

DLGAP1-AS2可以调节的miR-503 /细胞周期蛋白D1,以促进在NSCLC细胞增殖。

同行审查报告

背景

肺癌是双方之间的女性癌症死亡的主要原因,全世界男性[12].2018年,它约占所有新癌症病例的11.6%,导致了所有癌症死亡的18.4% [3.].超过一半的肺癌患者诊断为早期阶段可以存活超过5年[4.]. 然而,肿瘤转移到远处器官,如脑、骨和肝,在肺癌患者中很常见[5.].尽管努力治疗转移性肺癌患者,但只有不到5%的患者能存活5年以上[5.].吸烟是导致肺癌的主要因素,而肺癌也影响从不吸烟的人[6.7.],表明有其他内部及/或环境因素的参与。

在过去的几十年中,肺癌的分子病理学的研究已经揭示,在肺癌的生长和转移的关键功能的多个信号传导途径[8.]. 随着我们对肺癌分子机制的理解不断加深,新的治疗方法,如可用于抑制肿瘤生长和转移的靶向治疗已经被开发出来[9.10.].然而,肺癌的有效目标仍然缺乏。LNCRNA和miRNA是通过调节相关基因的表达参与癌症的NOODING RNA(NCRNA)[11.12.]这表明lncRNAs和miRNAs是癌症治疗的有希望的靶点。在最近的一项研究中,DLGAP1-AS2被报道促进胶质瘤的发展[13.].我们进行了生物信息学分析,预测了DLGAP1-AS2与miR-503之间潜在的相互作用,靶向cyclin D1抑制肿瘤生长[14.].本研究旨在探讨DLGAP1-AS2、miR-503和cyclin D1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的相互作用。

方法

病人和后续

该研究经安徽省胸科医院伦理委员会(编号:Ach#965)批准,于2013年5月至2015年5月期间共纳入64名非小细胞肺癌患者(42名男性和22名女性)。这些患者年龄在46至68岁之间,平均57.6岁 ± 6.6年。(1)患有其他临床疾病或复发性NSCLC,(2)接受过既往治疗,(3)死于非NSCLC疾病的患者被排除在研究之外。这64名患者被分为AJCC I期或II期(n = 26)和第三或第四阶段(n = 38). 所有患者每月随访一次,共5年,记录其生存状况。获得所有患者的书面知情同意书。64例非小细胞肺癌患者的临床病理参数如表所示1

在64名NSCLC患者与临床病理参数DLGAP1-AS2表达的表1中的相关性

非小细胞肺癌组织和细胞

治疗前,通过细针穿刺从每位患者收集非小细胞肺癌组织及其配对的非肿瘤组织,通过组织病理学分析进行确认,并储存在液氮中进行后续分析。

H2170 NSCLC细胞系(ATCC®CRL-5928™)购自ATCC(美国)和在5%CO补充有10个%FBS的RPMI培养基中培养2培养箱温度为37℃,湿度为95%。

瞬态转染和双荧光素酶报告器测定

使用PCDNA3.1作为骨架载体(Invitrogen)构建DLGAP1-AS2或Cyclin D1表达载体。MiR-503的阴性对照(NC)miRNA和模仿从Sigma-Aldrich购买。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用1μgdLgap1-AS2或40nm miR-503转染H2170细胞。用空载体或Nc miRNA转染细胞作为Nc。此外,未转染的细胞用作对照(C)。

以pGL3荧光素酶载体为骨干(Promega)构建DLGAP1-AS2荧光素酶报告载体,与miR-503 mimic (miR-503组)或+ NC miRNA (NC组)共转染H2170细胞。转染48 h后,荧光素酶活性检测DLGAP1-AS2与miR-503 mimic之间的相互作用。

RNA隔离

使用核糖唑试剂(Invitrogen)从成对组织样本和H2170细胞中分离总RNA。在37°C下用DNase I(Invitrogen)处理100分钟以完全去除基因组DNA后,通过6%尿素PAGE凝胶电泳检查RNA完整性。通过OD260/280比率反映RNA样品的纯度。

RT-qPCR

使用SS-IV-RT系统(Invitrogen)对RNA样本进行逆转录(RTs),制备cDNA样本。采用SYBR Green Master Mix (Bio-Rad)以18S rRNA为内参的qpcr检测DLGAP1-AS2和cyclin D1 mrna的水平。使用All-in-One™miRNA qRT-PCR试剂试剂盒(genecoopoeia)检测MiR-503水平,以U6为内对照。

每个实验中包含三种技术复制。使用2的方法标准化CT值−ΔCt[15.16.].在qPCR中使用的引物DLGAP1-AS2正向5'-TTCCTGTCTTTCAGGATGAATGCC-3'和反向5'-TGGTAGC CTGTGGCGAGTTGAA-3';细胞周期蛋白D1正向5'-CGAGGAGCTGCTGCAAATGG-3'和反向5'-CAGAGGGCAACGAAGGTCTG-3';18S rRNA基因正向5'-GAG AAACGGCTACCACATCCA-3'和反向5'-CGTGCCATCCCAAAGTCCAAC-3';的miR-503正向5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'和反向5'-GTAATA CGGTTATCCACGCG-3';和U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

Western Blot.

用RIPA溶液(Invitrogen)从H2170细胞中提取蛋白。采用BCA分析(Invitrogen)定量后,将等量的蛋白在95℃变性10分钟,SDS-PAGE凝胶电泳分离,转移到PVDF膜上。用5%脱脂乳(PBS)在室温下孵育2小时,然后用抗cyclin D1 (ab194972, Abcam)和GAPDH (ab9845, Abcam)的一抗在4℃下孵育16小时。然后用HRP IgG二抗(ab6721, Abcam)在25℃下孵育3 h。使用ECL (Invitrogen)开发蛋白质信号,使用Quantity One软件检测、分析并归一化到对照组。

单元计数套件-8(CCK-8)测定

将转染的H2170细胞转移至96孔细胞培养板,该培养板含有0.1 ml培养基,每孔含有3000个细胞,并在37°C下培养。在与10%CCK-8溶液孵育后2小时,每24小时测量450 nm处的OD值,共4天。

细胞集落形成试验

H2170细胞(1 × 103.用所示载体转染的细胞(细胞/孔)在6孔板中铺板,并在37℃下在含5%CO的增湿培养箱中培养214天。菌落用100%甲醇固定,用0.1%结晶紫染色,计数并分析。

统计分析

在配对组织DLGAP1-AS2水平表示为平均的三个技术重复,通过配对t检验。Luciferase activity was expressed as Mean ± SD value and compared by unpaired t-test. Data from multiple transfection groups was expressed as Mean ± SD value of three biological replicates and compared using ANOVA Tukey’s test. To perform survival analysis, the 64 patients were divided into high and low DLGAP1-AS2 level groups (n = 32) with the median value as the cutoff. Survival curves were plotted for both groups and compared using log-rank test.p< 0.05为有统计学意义。

结果

DLGAP1-AS2在NSCLC中过表达,与NSCLC患者的低生存率相关

在从64例NSCLC收集组织和其配对的非肿瘤组织DLGAP1-AS2表达通过RT-qPCR测定。DLGAP1-AS2在比配对的非肿瘤组织NSCLC组织中过表达显著(图1一种,p< 0.05)。生存曲线分析显示,DLGAP1-AS2高水平组NSCLC患者的总生存率显著低于DLGAP1-AS2低水平组(图)。1B).因此,NSCLC中DLGAP1-AS2过表达与NSCLC患者的低生存率相关。此外,与配对的非肿瘤组织相比,miR-503在非小细胞肺癌组织中显著下调(图。1C,p< 0.05)。

图。1
图1

DLGAP1-AS2在NSCLC中过表达,与NSCLC患者的低生存率相关。RT-qPCR检测64例NSCLC组织及其配对的非肿瘤组织中DLGAP1-AS2和miR-503的表达。配对组织中的DLGAP1-AS2表达为3个技术重复的平均值(一种). ***p < 0.001。For survival analysis, the 64 patients were divided into high and low DLGAP1-AS2 level groups (n = 32). Survival curves were plotted for both groups and compared using the log-rank test (B.). 配对组织中的MiR-503表达水平表示为三次技术复制的平均值(C). ***p < 0.001

DLGAP1-AS2和miR-503直接彼此交互

通过IntaRNA 2.0预测DLGAP1-AS2与miR-503之间的相互作用。我们观察到DLGAP1-AS2和miR-503可以形成多个碱基对(图)。2一种)。双荧光素酶报告基因检测分析表明,该荧光素酶活性显著所述miR-503组中的降低相比,NC组(图2B,p < 0.05)那suggesting a direct interaction between them.

图2
figure2

DLGAP1-AS2和miR-503直接相互作用彼此。DLGAP1-AS2和miR-503之间的相互作用通过IntaRNA 2.0(预测一种).对于双荧光素酶报告结果,使用Lipofectamine 2000将DLGAP1-AS2荧光素酶向量+ miR-503模拟(MiR-503组)或DLGAP1-AS2荧光素酶向量+ NC miRNA(NC组)共转染到H2170细胞中。荧光素酶活性是在转染后48小时测量(B.

DLGAP1-AS2和miR-503的过度表达未能调节彼此的表达

为了进一步探索DLGAP1-AS2和miR-503之间的相互作用,用DLGAP1-AS2表达载体或miR-503模拟物转染H2170细胞,然后通过RT-qPCR确认转染(图。3.一种,p < 0.05). 观察到DLGAP1-AS2的过度表达未能显著改变miR-503的表达(图。3.B)。此外,过表达miR-503对DLGAP1-AS2的表达也没有显著影响(图2)。3.C).因此,DLGAP1-AS2不太可能是miR-503的靶点,可能作为miR-503的内源性海绵。

图3.
图3

而过表达DLGAP1-AS2和miR-503则无法相互调节表达。为了进一步研究DLGAP1-AS2与miR-503的相互作用,将DLGAP1-AS2表达载体或miR-503 mimic转染H2170细胞,然后通过RT-qPCR (一种).此外,DLGAP1-AS2过表达对的miR-503的影响(B.)以及miR-503过表达对DLGAP1-AS2的影响(C)进行RT-qPCR分析。用三个生物重复的平均值±SD值表达多个转染组的数据。*p < 0.05

DLGAP1-AS2过表达增加了细胞周期蛋白D1的表达,后者是miR-503的靶点

为了探讨DLGAP1-AS2作为miR-503的内源海绵起到这种可能性,通过RT-QPCR探索了DLGAP1-AS2和MIR-503过表达对细胞周期蛋白D1表达的影响(图。4.A)和Western印迹(图4.B) 。DLGAP1-AS2过表达增加了细胞周期蛋白D1的表达,而与NC miRNA相比,瞬时转染miR-503模拟物降低了细胞周期蛋白D1的表达(p< 0.05)。同样,如图S1所示,分别使用cyclin D1- sirna和cyclin D1过表达载体下调和过表达cyclin D1。通过转染cyclin D1- sirna逆转DLGAP1-AS2过表达诱导的cyclin D1表达(p< 0.05)。此外,在转染miR-503 mimic的细胞中,cyclin D1表达下调,而转染miR-503 mimic + pcDNA3.1-DLGAP1-AS2可逆转过表达miR-503对cyclin D1表达的影响(图)。4.B,p < 0.05). 此外,在转染miR-503抑制剂的细胞中,细胞周期蛋白D1表达上调,并且通过转染miR-503抑制剂逆转DLGAP1-AS2过度表达对细胞周期蛋白D1表达的影响(补充文件1:图S1,p< 0.05)。

图4.
装具

DLGAP1-AS2过表达增加了cyclin D1的表达,这是miR-503的一个靶点。为了验证DLGAP1-AS2作为miR-503内源性海绵的可能性,我们通过RT-qPCR研究了DLGAP1-AS2和miR-503过表达对cyclin D1表达的影响(一种)及Western blot (B.). 卑鄙 ± 使用三个生物复制的SD值来表达多个转染组的数据*p < 0.05

DLGAP1-AS2 / miR-503 / Cyclin D1途径调节H2170细胞增殖

通过CCK-8和细胞污染物形成测定分析DLGAP1-AS2,MIR-503和Cyclin D1对H2170细胞增殖的影响的影响。如图1所示。5.A,与空载体相比,过表达DLGAP1-AS2或cyclin D1可增加细胞增殖(p< 0.05)。此外,分别与NC miRNA和未处理的对照,(相比的miR-503模拟物和细胞周期蛋白D1-siRNA的瞬时转染降低H2170细胞增殖p< 0.05)。此外,通过转染miR-503模拟PCDNA3.1-DLGAP1-AS2,通过转染miR-503过表达诱导的效果反转(p< 0.05)。一致地,如图2所示。5.B,C,细胞群形成测定显示,与NC miRNA相比,miR-503过表达导致较少且较小的菌落,通过转染miR-503模拟PCDNA3.1-DLGAP1-AS2组(p< 0.05)。这些结果表明,过表达DLGAP1-AS2降低了过表达miR-503对细胞增殖的影响。

图5.
图5.

DLGAP1-AS2 /miR-503/cyclin D1通路调控H2170细胞增殖。通过CCK-8法分析过表达DLGAP1-AS2、miR-503和cyclin D1对H2170细胞增殖的影响(一种).在H2170细胞中,转染指示载体14天后细胞集落形成(B.C). 卑鄙 ± 使用三个生物复制的SD值来表达多个转染组的数据*p < 0.05

讨论

本研究探讨了DLGAP1-AS2与非小细胞肺癌中miR-503/cyclin D1轴之间的相互作用。结果显示DLGAP1-AS2在NSCLC中过度表达,并通过分泌miR-503上调细胞周期蛋白D1,促进NSCLC细胞增殖。

DLGAP1-AS2的功能仅在胶质瘤中进行了分析[13.].观察到DLGAP1-AS2在胶质瘤中过表达,上调的YAP1以促进胶质瘤细胞增殖和转移[13.]. 然而,DLGAP1-AS2与其他癌症的关系尚不清楚。在本研究中,我们发现DLGAP1-AS2在NSCLC中显著过度表达,并且DLGAP1-AS2过度表达增加了NSCLC细胞的增殖率,表明DLGAP1-AS2在NSCLC中的过度表达可能通过促进癌细胞增殖发挥致癌作用。

尽管NSCLC在治疗方面做出了努力,但NSCLC患者的总体生存率仍然很低[17.18.]. 我们发现DLGAP1-AS2的高表达水平与NSCLC患者的低生存率密切相关。因此,测量癌症组织中DLGAP1-AS2的表达水平可能为开发个性化治疗提供指导,从而提高患者的生存率。然而,需要临床试验来验证我们的假设。

MIR-503在扮演着不同类型的癌症[不同的角色14.19.]. 例如,miR-503在结直肠癌中过度表达并促进癌症进展[19.]. 细胞周期蛋白D1是miR-503的靶点,在多种癌症中起着关键作用。Jiang等人发现miR-503下调通过靶向细胞周期蛋白D1促进食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞的增殖、迁移和侵袭[14.];朗等人。发现miR-503通过抑制细胞周期蛋白d1表达来抑制人乳腺癌细胞增殖(20.);徐等人。[21.]发现miR-503通过负性调节细胞周期蛋白D1抑制子宫内膜样子宫内膜癌细胞增殖和周期进展。然而,靶向细胞周期蛋白D1的miR-503在非小细胞肺癌中的作用尚不清楚。因此,在本研究中,我们选择细胞周期蛋白D1作为潜在靶点,并表明miR-503也可能靶向NSCLC细胞中的细胞周期蛋白D1以减少细胞增殖。我们发现DLGAP1-AS2直接与miR-503相互作用以调节细胞周期蛋白D1的表达,但对miR-503的表达没有影响。在其他lncRNAs中也发现了类似的现象。杨等人[22.显示lncRNA MIR31HG具有miR-193b海绵的功能,但MIR31HG下调或过表达后对miR-193b水平无显著影响。Yang等也发现过表达miR-193b可抑制MIR31HG的表达和功能,提示MIR31HG是miR-193b的作用靶点。然而,在我们的研究中,miR-503过表达对DLGAP1-AS2的表达没有影响,提示DLGAP1-AS2不太可能是miR-503的靶点。因此,miR503过表达通过下调细胞周期蛋白D1的表达来抑制H2170细胞的增殖,而DLGAP1-AS2过表达可能起到“海绵”的作用,通过竞争miR-503结合来上调细胞周期蛋白D1的表达,从而促进H2170细胞的增殖。总之,我们的研究表明,过表达DLGAP1-AS2降低了过表达miR-503对cyclin D1表达和细胞增殖的影响。因此,DLGAP1-AS2可能在NSCLC中吞噬miR-503。

结论

DLGAP1-AS2在NSCLC中过度表达,可能通过吸附miR-503上调细胞周期蛋白D1,从而促进NSCLC细胞增殖。

提供支持数据的可用性

支持本研究调查结果的数据可应要求提供相应的作者:宁旭,安徽省安徽省蜀山区九溪路397号九西路397号胸部外科系近徐。电子邮件:ningxuhefei@163.com。由于包含可能损害研究参与者隐私的信息,某些数据不会被公开使用。

缩写

NSCLC:

非小细胞肺癌

ncrnas:

非编码RNA

ESCC:

食管鳞状细胞癌

NC:

阴性对照

C:

控制

CCK-8:

细胞计数Kit-8

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致谢

不适用。

资金

不适用。

作者信息

隶属关系

作者

贡献

LW,NX:学习概念,文学研究,临床研究,数据分析,实验研究,稿件写作和评论;LT,TF G:研究设计,文学研究,实验研究和手稿编辑;FZ:智力内容的定义,临床研究,数据采集和统计分析;DL:数据采集,稿件准备和数据分析;HG,PQ:数据采集和统计分析。所有作者都读过并批准了稿件。

通讯作者

通信Ning徐

伦理宣言

伦理批准和同意参与

所有研究参与者均获得知情同意。安徽胸科医院伦理委员会批准了这项研究。所有患者均提供书面知情同意书。

同意出版

不适用。

利益争夺

所有的作者都没有利益冲突。我们声明,我们没有任何与所提交的工作相关的利益冲突的商业或联合利益。

附加信息

出版商的注意

BOB体育网站Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

补充信息

附加文件1:图S1。

H2170细胞中细胞周期蛋白D1的相对水平。为了进一步揭示DLGAP1-AS2过表达增加了细胞周期蛋白D1的表达,我们用miR-503抑制剂和细胞周期蛋白D1- sirna载体转染H2170细胞,并通过Western blot检测细胞周期蛋白D1的表达。用三个生物重复的平均值±SD值表达多个转染组的数据。*p< 0.05。

权利和权限

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引用这篇文章

王,L.,唐,L.,葛,T。et al。LncRNA DLGAP1-AS2调节miR-503/cyclin D1促进非小细胞肺癌细胞增殖。BMC Pulm地中海21,277(2021)。https://doi.org/10.1186/s12890-021-01633-0

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关键字

  • 非小细胞肺癌
  • DLGAP1-AS2
  • mir-503.
  • 细胞周期蛋白D1