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香烟烟雾和COPD对SARS-CoV-2感染和疾病的矛盾作用

抽象的

背景

香烟烟雾(CS)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)如何影响严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV2)的感染和严重程度是有争议的。我们研究了COPD和CS对COPD患者、对照组和CS暴露小鼠体内SARS-CoV-2进入受体ACE2表达的影响,以及CS对体外人支气管上皮细胞SARS-CoV-2感染的影响。

方法

我们量化:(1)通过免疫染色和ELISA的肺ACE2蛋白水平,以及ACE2和/或TMPRSS2 mRNA水平在两个独立的人群中的RT-QPCR;(2)通过免疫染色和ELISA在C57BL / 6 WT小鼠中暴露于空气或Cs的肺部蛋白水平,最多6个月。在钙氏3细胞的体外感染和分化的人支气管上皮细胞(HBECs)的体外感染后,评估CS暴露对SARS-COV-2感染的影响。

结果

与对照组相比,COPD患者外周血管中ACE2蛋白和mRNA水平降低,但在中央气道中类似。与暴露于空气的小鼠相比,暴露于CS的小鼠支气管和肺泡上皮中ACE2蛋白水平降低。通过免疫荧光对复制双链RNA (dsRNA)的染色和病毒N蛋白的western blot检测,CS处理可降低Calu-3细胞中的病毒复制。通过空斑实验和RT-qPCR检测,急性CS暴露可降低体外SARS-CoV-2在HBECs中的复制。

结论

来自COPD患者对照的支气管和肺泡上皮细胞两种支气管和肺泡上皮细胞中的ACE2水平降低,并且来自CS暴露的与空气暴露的小鼠。CS-Pre-曝光在体外有效地抑制SARS-COV-2复制。这些调查结果促使进一步调查CS和COPD对SARS-COV-2感染的争议作用。

同行评审报告

背景

冠状病毒病-19 (COVID-19)是一种由新发现的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (SARS-CoV2)引起的急性和异质性临床疾病[1]. 在大多数情况下,该病的特征是轻微的呼吸道症状和/或胃肠道、神经系统和皮肤症状比例可变[2].当严重时,疾病会导致致命急性呼吸窘迫综合征。尽管全球巨大的负担,但我们对SARS-COV-2疾病的病理生理学和治疗的理解仍然有限。

老年人和患有患者的患者(主要是有氧/呼吸系统疾病,糖尿病和肾衰竭)的预后和死亡的最高风险 - 19 [3.].COPD是影响全球数百万的最常见的非传染性慢性病之一[4].慢性阻塞性肺病患者多为老年人,共病频繁。由于免疫反应不足[5], COPD与感染易感性增加有关,而病毒感染是COPD急性加重的主要原因之一。因此,SARS-CoV-2大流行可能对COPD患者产生显著的临床影响[6].有趣的是,到目前为止发布的流行病学数据显示在Covid-19患者中的活跃吸烟者和COPD的预期低于预期的患病率[7891011121314]. 另一方面,SARS-CoV-2感染后,COPD患者预后不良的风险很高,包括重症监护病房入院和死亡[15].

SARS-CoV-2使用血管紧张素转换酶2(ACE2)作为宿主细胞进入受体[16].SARS-CoV-2刺突(S)蛋白与ACE2的结合引发一系列复杂的生化反应(即激活包括跨膜丝氨酸蛋白酶2-TMPRSS2在内的特定蛋白酶)和分子信号,导致病毒内化。ACE2在肺中表达,其表达从传导到呼吸道开始下降,在较远的细支气管和肺泡肺区域减弱[17].有关于香烟烟雾(CS)和COPD对ACE2表达的影响的混合报告,大多数数据显示出吸烟者肺部和COPD患者的肺部调节[18192021,其他一些数据显示尼古丁下调ACE2轴[222324].因此,CS和COPD对SARS-CoV-2感染的影响仍有争议[25].

在这项研究中,我们评估了:(1)与吸烟者和从不吸烟者(NS)对照组相比,COPD吸烟者气道中ACE2和TMPRSS2的表达,以及(2)急性和慢性暴露于CS的小鼠肺中ACE2的表达;(3) CS提取物(CSE)或CS直接暴露对体外Calu3肺腺癌上皮细胞和分化的人支气管上皮细胞感染SARS-CoV-2的影响。

方法

研究人群

这项研究符合赫尔辛基的宣言,工作由机构伦理委员会批准(亚利桑那大学IRB#1811124026和法拉拉大学IRB#080399)。获得了每位受试者的知情书面同意。

肺标本取自不同的COPD患者队列(根据全球慢性阻塞性肺病倡议的定义)、非COPD吸烟者和对照非吸烟者(NS),如下所示。队列1:在意大利费拉拉大学医院接受肺切除术的肺结节吸烟者[26];队列2:在亚利桑那大学接受肺结节手术或肺移植的患者[27].从亚利桑那州供体网络(均来自图森,AZ)死于肺外原因的NS移植的肺被用作对照肺。

所有被定义为“吸烟者”的受试者都有至少10包/年的吸烟史,所有被定义为前吸烟者的受试者在研究前已经戒烟至少1年。

所有带有和没有COPD的吸烟者都根据国际准则进行了血液测量学。COPD患者根据全球阻塞性肺病疾病建议的倡议定义。排除标准是肺组织采样时呼吸道感染的证据,伴随的慢性肺病或转移性癌症,自身免疫性疾病,免疫抑制治疗或化疗的存在。在不包括COPD移植的两种队列中,肺组织在距肺部病变的最大距离处获得,并且没有复古阻塞性肺炎或肿瘤侵袭的迹象。

与意大利费拉拉大学招募的患者相比,亚利桑那大学(美国)招募的对照组和COPD患者明显更年轻。与意大利费拉拉大学的患者相比,亚利桑那大学(美国)招募的所有患者组的肺功能显著降低。在亚利桑那大学(美国)招募的COPD患者队列中,与意大利费拉拉大学招募的患者相比,较高但不显著的比例的COPD患者使用含有药物方案的ICS。

该研究符合《赫尔辛基宣言》,工作得到了地方伦理委员会的批准,并获得了每个受试者的知情书面同意。

中枢和外周气道ACE2的免疫组织化学检测

福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)人外周肺组织和人支气管环在意大利费拉拉大学收集。切片脱脂、复水后染色,浸于pH 6.0的柠檬酸提取液中,微波高倍孵育40分钟,暴露免疫反应表位。然后,冷却30分钟后,内源性过氧化物酶活性被3%过氧化氢(H2O2),然后用自来水清洗。将封闭血清(5%正常山羊血清(Thermofisher Scientific))涂于PBS中阻断非特异性标记;在PBS中加入0.1%的皂苷,使细胞膜在室温下渗透20分钟。去除阻断血清后,切片立即与一抗(兔多克隆抗ace2;PA5-20046, Invitrogen),室温下PBS/0.1%皂素稀释浓度为0.005 μg/μl (1:200) 60 min。用PBS/0.1%皂素重复洗涤步骤后,用PBS/0.1%皂素稀释的山羊抗兔生物素化抗体(BA-1000, Vector Laboratories)在室温下孵育30分钟。PBS/0.1%皂苷进一步洗涤后,用ABC试剂(Vector ABC Kit;PK-6100,载体实验室)在室温下用PBS稀释30分钟。PBS/0.1%皂苷多次洗涤后,载玻片与显色物质(D4293-50SET, Sigma)耐变色二氨基联苯胺(DAB)孵育2分钟。最后,切片在苏木精QS (H-3404, Vector Laboratories)中反染色,脱水,清除,用盖玻片固定在固定介质(VectaMount;h - 5000,向量实验室)。 Kidney tissue samples were utilized as positive controls, while negative controls were obtained either omitting the primary antibody or using isotype IgG, and revealed no signal. Cell-type specific staining was visualized under a light microscope (LeicaDM2000) connected to a video recorder and a computerized image analysis system (Leica LAS w3.8). ACE2 positive staining in epithelial cells was quantified in both central and peripheral airways and was expressed as the percentage of positively stained epithelial area over the total area of the epithelium.

通过外周气道和肺泡上皮细胞免疫荧光检测ACE2

肺FFPE部分被脱碱化,通过将浸入0.01M柠檬酸钠和2mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)浸入0.01M柠檬酸钠(pH6.0)中来进行抗原(Ag)检索。为了鉴定肺泡和支气管上皮内和血管内的Ace2阳性,肺切片是三重免疫染色的:(1)鼠抗Ace2 IgG(1:20过夜4°C,Santa-Cruz Biotechnology,Dallas,Tx,SC-390851)随后是Alexa-488 IgG(1:100,在37°C,Fisher Scientific,Hampton,NH,A11001);2)兔抗泛细胞角蛋白(作为上皮细胞的标志物,1:50过夜4℃,Bioss抗体,Woburn,MA,BS-1712R),然后再向Alexa-568 IgG(1:100持续1小时37°C,Fisher Scientific,Hampton,NH,A11036);3)绵羊抗VWF IgG(作为内皮细胞的标志物,1:50在37°C,Abcam,Cambridge,UK,AB11713),然后是Alexa-647 IgG(1:100在37个°C,Abcam,Cambridge,UK,AB150179)。

为了鉴定支气管上皮内ace2阳性杯状细胞,对肺切片进行双免疫染色:(1)小鼠抗ace2 IgG(1:20过夜,4°C, Santa-Cruz biotechnology, sc-390851),其次是Alexa-568 IgG(1:100在37°C, Fisher Scientific, Hampton, NH, A11004);(2) rabbit MUC5AC (1:50 overnight a 4°C, Bioss antibody, Woburn, MA bs-7166R),其次是Alexa-488 IgG (1:100 for 1 h at 37°C, Fisher Scientific, A11034)。肺切片也用合适的同型匹配的非免疫对照抗体进行免疫染色。对于每个样品,使用奥林巴斯外源性荧光显微镜(Olympus Global Corporation)随机选择20个高倍放大场进行评估。分别计算实质、血管和支气管ACE2+细胞的数量,数据分别以实质、支气管和血管ACE2+细胞/肺泡、支气管和血管组织面积的平均值或中位数表示。同时计算ACE2+ MUC5AC+细胞在支气管上皮内MUC5AC+细胞总数中的百分比。

ACE2和TMPRSS2实时PCR

RNA是从亚利桑那大学收集的新鲜冷冻肺中提取的。使用RNeasy从亚利桑那大学采集的肺冷冻组织匀浆中分离出总RNA®Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)。按照制造商的说明,用DNase (Invitrogen)处理纯化的总RNA。根据制造商的说明书使用SuperScript™II RNase H进行逆转录逆转录酶(表达载体)。设计PCR反应的引物,获得每个信息ORF大小相近的特异性PCR产物:ACE2: 5 ' -TCCATTGGTCTTCTGTCACCCG-3 ' (Fw.)和5 ' -AGACCATCCACCTCCACTTCTC(Rev.)-3 ';和TMPRSS2: 5 ' -CCTCTAACTGGTGTGATGGCGT-3 ' (Fw.)和5 ' -TGCCAGGACTTCCTCTGAGATG-3 ' (Rev.)。采用iQ™SYBR进行实时RT-PCR反应®Green Supermix (BIORAD),缓冲在:95°C, 10分钟,1次循环;94°C, 10 s;60°C, 30 s和72°C, 30 s, 40个循环;在MyiQ™循环器(BIORAD)中,熔化曲线的温度范围从55°C到95°C。qPCR计算相对定量采用Delta-delta Ct法。使用人微管蛋白作为内部管理基因,对每个患者样本(5 ' - CTTCGGCCAGATCTTCAGAC-3 ' (Fw.)和5 ' - agagtgggtcagctggaa -3(Rev.)的ACE2和TMPRSS2的放大Ct值进行归一化。简单地说,假设在每个周期内有两次扩增,将Tubulin的平均Ct值从ACE2和TMPRSS2 Ct值中减去。所有的样品都作为技术复制品运行。在一小部分受试者中,我们也测试了其他地方报道的ACE2非功能性亚型[28].

人类ACE2 ELISA

使用人血管紧张素I转换酶2 ELISA试剂盒(Reddot Biotech Inc., Kelowna, BC V1W 4V3, Canada)对亚利桑那大学收集的肺冷冻组织的肺均质物进行了人ACE2 (hACE2) ELISA。试剂、样品和标准品按生产厂家指南进行制备。简单地说,每孔加入100µL标准品或样品,在37°C孵育2 h。然后加入100µL制备的检测试剂A和B,在37℃连续孵育1 h。所有孔洗涤5次,加入90µL底物溶液。在37℃下18分钟显色效果最佳。加入停止液,立即在450nm读取板。在pg ACE2/µg总蛋白中报告了ACE2水平。

动物研究

所有小鼠研究均由布里格姆和妇女医院(BWH) IACUC委员会批准,并按照BWH IACUC和ARRIVE指南进行。

将C57BL / 6 WT小鼠暴露于空气或CS,最多6个月[2930.].将成年人WT小鼠暴露于空气或混合的主流和侧沟卷烟烟雾,来自3次肯塔基研究卷烟2 H·Day-1在6天·Tear-1在Tegue Te 10z Chambers(Teague Enterprises,Ca,USA)中为1-6个月。

小鼠支气管和肺泡上皮细胞中的ACE2免疫荧光

为了鉴定肺泡组织和支气管上皮组织内的鼠细胞中的Ace2蛋白,肺部是三重免疫染色:(1)小鼠抗Ace2 IgG(1:50在37°C,Santa-Cruz Biotechnology,Dallas,TX,SC-390851)随后是Alexa-488 IgG(1:100,在37°C,Fisher Scientific,Hampton,NH,A11001);(2)大鼠抗CD326(EPCAM,2小时,4℃,Biolegend,San Diego,Ca,118201),然后达到Alexa-647 IgG(1:100,在37°C,Fisher,Fisher科学,汉普顿,NH,A21247)和3)兔抗MUC5AC IgG(1:50在4°C,生物抗体,Woburn,MA,BS7166R),然后是Alexa-568 IgG(1:100持续1小时在37°C,Fisher Scientific,Hampton,NH,A11036)。EPCAM用于鉴定肺泡和支气管上皮细胞,并且使用MUC5AC来鉴定支气管壁内的脚杯细胞。肺切片也与适当的同种型匹配的非免疫对照抗体免疫染色。

对于每个样品,使用奥林巴斯外源性荧光显微镜(Olympus Global Corporation)随机选择20个高倍放大场进行评估。分别计算实质、血管和支气管ACE2+细胞的数量,数据以实质、支气管和血管ACE2+细胞的平均或中位数/mm表示2分别是肺泡、支气管或血管问题区。同时计算ACE2+ MUC5AC+细胞在支气管上皮内MUC5AC+细胞总数中的百分比。使用MetaMorph软件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)测量组织面积。

鼠ACE2 ELISA

使用小鼠血管紧张素I转换酶2 ELISA试剂盒(MyBiosource, San Diego, CA, MBS824565),对从布里格姆妇女医院收集的肺冷冻组织的肺均质物进行M-ACE2酶联免疫吸附试验。试剂、样品和标准品按生产厂家指南制备。ACE2水平以总蛋白mg为标准。

体外SARS-CoV-2感染

香烟烟雾提取物

在使用以下已验证过的方法之前,每个实验都立即制作新鲜的CSE [2131.].使用的香烟是肯塔基大学的3 r4f参考香烟(朱凌翔慷慨的礼物)。简单地说,整个香烟被吸收到10毫升的BEGM™在75厘米2组织培养瓶。烟以每次50毫升的速度被拉上来,并直接注入烧瓶中,立即重新盖上盖子。根据燃烧速率的不同,这一过程被重复到总共250 - 300cc的烟雾/ 10mls BEGM™。烟被允许完全吸入媒体中。

Calu-3细胞培养

人肺腺癌细胞转移部位(ATCC)®HTB-55),允许SARS-COV-2感染和复制的线路[32.33.],购自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)根据制造商的说明购买和维护。简言之,将细胞接种最初以30,000细胞/ cm2在T-75烧瓶中,并在DMEM高糖(Gibco)中保持™ 10569-010)添加10%FBS GenClone™ 胎儿期™ (类别#:25-525H)。治疗前每隔一天更换一次培养基。为了研究CS暴露对SARS-CoV-2感染的影响,我们对Calu-3肺腺癌细胞进行了72小时的体外感染。在感染SARS-CoV-2分离物(USA-WA1/2020,3小时时病毒感染2小时)之前,对细胞进行假手术或CSE处理24小时 × 10e6PFU /毫升,在正常培养基,然后取出接种物)。每24次小时将细胞固定为IF染色,或裂解物/从细胞的病毒核壳(N)蛋白的WB获得上清液:和ACE2(Novusbio(Novusbio NB100-56683,1在TBST 500稀释在1%牛奶)NBP1-76614,1:500稀释在1%牛奶的TBST)。IF染色病毒RNA,在此期间出现的dsRNA中间体(的vRNA)的复制,被用dsRNA特异性J2的mAb执行的处理32.34.35.(Scicons # 10010500)。简单地说,细胞在含有4% PFA和4%蔗糖的PBS中固定30分钟,用0.2% Triton X-100/PBS渗透10分钟,用5% BSA/PBS封闭1小时,然后用J2 mAb染色[32.34.35.]在4℃下为1:1000稀释1小时。然后将细胞用0.1%Tween-20 / PBS(PBST)洗涤3次,并在浅山甘露抗小鼠Alexa氟5461:1,000(热#A11003)中在黑暗中孵育2小时。用PBST洗涤3×,在黑暗中在室温下与DAPI温育30分钟。然后使用20×目的将板与尼康Eclipse Ti2自动显微镜系统成像。通过尼康元素成像软件测量每孔的六个框架,并将其归一化为细胞计数的DSRNA荧光强度,由DAPI测量。

人支气管上皮细胞气液界面原代培养

人支气管上皮细胞培养试剂盒(目录#:CC-2540S)购自Lonza Bioscience(马里兰州沃克斯维尔)。细胞根据公司的协议重新启动、播种和维护。简单地说,细胞最初被镀上75厘米厚的金属板,以便于扩大2组织培养瓶,3500细胞/厘米2并保持含有相应的BulletKit™(Lonza#:CC-3170)的定义的血清自由支气管上皮生长培养基。在膨胀后,将细胞接种在大鼠尾胶原上,30.0μg/ ml(康宁 - 剑杆,剑桥MA#354236),在50,000个细胞/孔中涂覆的反式阱板(康宁 - 剑杆#354236)并允许汇合。汇合后,细胞被“空气抬起”(除去所有介质,允许直接空气曝光),并且基础室介质被改变为补充B-Alitm Singlequots™的B-Alitm差异化培养基(Lonza目录#00193517)(LONZA目录#00193515)。媒体变化每天向基础室进行,直至治疗。

当汇合时,通过在Transwell插入件的顶端侧用150μLPBS洗涤空气暴露的Ali-HBec,以透明粘液。两小时后,将平板/细胞暴露于新生生成的CSE(见上文)。细胞暴露在修饰的缺氧室中进行5分钟,以浓度为186.7 mg / m的香烟烟雾3.(TSP)或过滤周围空气(“假”)。随后,用周围空气通风5分钟,清除残留烟雾(或假空气),随后将细胞放回培养箱过夜。在接触香烟烟雾24小时后,用PBS清洗ALI-HBEC,准备感染SARS-CoV-2。

CSE暴露后HBECsγH2AX的表达

To confirm thst CSE was causing oxidative stress on the HBECs, identify gamma H2AX expression, primary HBEC’s were plated on rat tail collagen coated glass coverslips, 30.0 µg/ml, (Corning-Costar, Cambridge MA #354236) at 50% density and allowed to adhere overnight. After either smoke or sham air treatment, cells were immunostained with gamma H2AX [p Ser139] Antibody (Novus Biologicals LLC, Centennial, CO # NB100-384). Briefly, cells were fixed with 4% formaldehyde for 15 min, permeabilize with 0.1% TX-100/PBS for 15 min and blocked with 5% normal goat serum/PBS or 1% BSA/PBS for 1 h. Rabbit anti-human gamma H2AX [p Ser139] Antibody was diluted at 1:250 in blocking solution and cells were allowed to incubate overnight at 4 °C. Following washes, the cells were incubated with goat anti-Rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA # A11034) at a dilution of 1:200 in blocking solution for 1 h at room temperature. Post wash, coverslips were dipped into dHO to remove residual salts of the wash buffer and mounted with ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI (Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA #P36935). A secondary only slide was used to evaluate any background staining.

HBEC SARS-CoV-2感染

Transwell插入物放置在12孔板中,并加入1ml基底外侧介质。将SARS-CoV-2接种物(MOI为0.05 PFU/细胞)或单独培养基加入根尖室,37℃孵育1 h。然后用PBS洗涤细胞以去除所有未结合的病毒,然后将细胞放回培养箱,将顶部的腔室空着,随时间推移进行ALI培养。对于RT-qPCR检测,用200ul trizol收集总RNA,使用Direct-Zol RNA迷你prep提取RNA (Zymo research, Cat No.;R2050)工具包,根据制造商的说明。将纯化的RNA用Turbo DNA free kit (Invitrogen AM1907)处理,去除样品中的所有基因组DNA。SARS-CoV-2核衣壳基因是量化使用2019 - ncov RUO工具包(IDT 10006713)含有N2底漆集(底漆:TTA创新艺人经纪公司ACA TTG GCC GCA AA,反向引物:GCG CGA猫苑棉酚棉酚)和TaqPath™互译RT-qPCR方法(热费舍尔A15299),在QuantStudio6 Flex实时PCR系统(ThermoFisher科学)。Delta-delta-cycle阈值(ΔΔCt)的测定相对于假处理样品。病毒RNA水平归一化至管家RNAse P基因(RP,引物由2019-nCoV RUO Kit提供,IDT 1006713,正向引物:AGA TTT GGA CCT GCG AGC G,反向引物:GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT),描述为载体处理样品的折叠变化。误差条表示从n = 2或3个技术重复的SEM。

对于菌斑分析,通过在transwell的顶端添加200微升新鲜培养基对感染的HBEC细胞进行取样,混合,并在收集前在37℃下培养10分钟。通过将这些样品的连续稀释液应用于融合的Vero-CCL81细胞(ATCC CCL-81-VHG),在37℃下持续2小时,然后覆盖含有1.0%w/v甲基纤维素的完整培养基,进行菌斑测定。感染72小时后,vero细胞在10%中性缓冲福尔马林中固定30分钟,并用0.9%结晶紫染色5分钟。染色后计数斑块,并通过“斑块数”×稀释因子×体积因子计算每毫升斑块形成单位(PFU/ml)。

统计数据

我们使用单向分析对于连续变量和Z测试或分类变量的Chi-Square测试进行单向分析。对于成对比较,分别使用双面学生的T测试和Mann-Whitney U测试分析了参数和非参数数据。使用Pearson或Spearman等级方法计算相关系数或用于非线性数据的DUBIN-WATSON统计相关测试。P小于0.05被认为有统计学意义。

使用SPSS统计软件进行分析。

由于老年人和男性更易感染SARS-CoV-2,提示这可能与ACE2的表达随年龄和性别的变化有关,测试了ACE2+细胞在支气管和肺泡上皮细胞中的分布的正态性,并在需要时应用log base 10转换以达到近似正态分布。采用多元线性回归检验ACE2测量值与患者分组的关系,校正年龄和性别。估计系数的线性组合用于COPD和SC组的比较。由于在队列2中,NS明显比SC和COPD年轻,因此使用线性回归模型对ACE2和TMPRSS2水平进行了年龄调整。

结果

查看其他文件1和桌子12查阅有关研究对象的更多细节。COPD患者的两个独立人群队列[36.[没有COPD的吸烟者(“吸烟者”)和从不吸烟的控制(NS)。

表1队列1费拉拉大学COPD和对照组
表2队列2:亚利桑那大学和亚利桑那州捐助网络:COPD患者和控制

在群组1中,在长螺旋细胞和支气管上皮细胞的顶端表面上观察到ACE2表达。在COPD中央航空公司的ACE2表达中没有发现任何差异(5.3%±2.9),而没有COPD的吸烟者和NS对照(4.7%±2.9和7.2%±3.5,则。1A和附加文件1:图S1A)。相比之下,COPD患者外周血管中ACE2表达水平(平均值+ SEM: 1.5%±0.7)低于吸烟者和NS对照组(6.1%±1.7;6.6%±2,P< 0.05和P = 分别为0.01,图。1B和附加文件1:图印地)。同样,在队列2中,我们发现两个肺泡(主要是II型细胞,ATII,图。1B, D)和细支气管细胞(主要是杆状细胞和杯状细胞,图。1C、D) ACE2蛋白表达水平和ACE2 mRNA肺表达水平(图1)1e)在COPD患者中较低,而没有COPD和NS对照的吸烟者。当我们测量ACE2的非功能性同种型的mRNA表达时获得了相同的结果,我们在COPD与患者中发现较低。ns肺(附加文件1:图。S2)。我们没有观察到Bronchi的Ace2表达中的任何差异,或者在当前与前吸烟者之间的肺泡,无论它们是否具有COPD(图。1E,红色圆圈),也不能在COPD GOLD期之间(未显示)。在调整了年龄和性别后,ACE2 mRNA水平仍然显著降低(P < 0.05) in COPD lung versus smoker and NS controls. The ACE2 mRNA expression significantly correlated with its protein levels measured by ELISA (P= 0.01 and r = 0.71,附加文件1:图S3)在所有分析的受试者中。与ACE2不同,各组间TMPRSS2 mRNA水平没有差异(P= 0.9对于所有比较)。各组血管中ACE2蛋白水平无差异。

图。1
图1

来自COPD患者,吸烟者和从不吸烟的支气管和肺泡上皮的ACE2表达,吸烟者(NS)控制。中央气道支气管上皮中ACE2 +细胞的数量在慢性阻塞性肺病(COPD),没有COPD和NS对照的患者之间相似。在一个,COPD患者(上图)中央气道的ACE2图像的代表性IHC和没有COPD的吸烟者。插入显示纤毛支气管上皮细节。肺泡上皮中Ace2 +细胞的数量(B)和外围气道上皮(C),肺泡壁或基底膜的长度标准化,COPD患者比非COPD吸烟者和NS对照组低。在D,来自COPD患者的肺泡(上面板)和支气管上皮(下面板)的三重免疫荧光代表性图像,一种没有COPD的吸烟者,以及通过绿色荧光染料鉴定ACE2染色的从不吸烟者(NS),所识别上皮通过合并两种荧光染料,获得红色荧光染料和颜色黄色。在E慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者与非COPD吸烟者和NS对照组相比,外周肺样本中ACE2 mRNA水平降低。红色圆圈表示吸烟者对照组和COPD患者中的当前吸烟者

在小鼠中,我们发现CS暴露时间越长,两个支气管中的ACE2染色水平越低(图2)。2A,B)和肺泡(图。2A, C)上皮细胞。不出所料,CS暴露6个月的小鼠出现了类似copd的表型,伴有空气空间增大和小气道重塑[30.37.],并且具有显着高的Muc5ac +支气管细胞数与空气暴露的小鼠。类似地,Cs-曝光的小鼠在支气管上皮细胞上具有较低的Ace2 + Muc5Ac + /总Muc5Ac +细胞与空气暴露的小鼠(P < 0.05 for all comparisons, not shown). ELISA-measured pulmonary ACE-2 protein levels were significantly lower in 1-month CS- versus air-exposed mice (P< 0.001,无花果。2D)。

图2
图2.

在从小鼠支气管和肺泡上皮的ACE2表达暴露于室内空气和急性或慢性于香烟烟雾(CS)。WT C57BL6 mice were exposed to air or cigarette smoke (CS) for up to 6 months (n = 3/4 group). In一个与1、3和6个月暴露于空气的小鼠相比,6个月暴露于cs的小鼠支气管上皮中ACE2+细胞的数量减少。cs暴露3个月的小鼠与3个月和6个月的小鼠相比,支气管上皮中ACE2+细胞的数量减少。cs暴露6个月小鼠支气管上皮中ACE2+细胞数量较cs暴露1个月小鼠减少。cs暴露6个月和3个月的小鼠肺泡上皮中ACE2+细胞的数量比暴露1个月和6个月的小鼠减少。cs暴露6个月小鼠肺泡上皮中ACE2+细胞数量较cs暴露1个月小鼠减少。在B,空气暴露(上3组)和cs暴露(下3组)小鼠小气道的代表图像,其中支气管上皮细胞用红色荧光团染色,粘蛋白产生细胞用青色荧光染色,ACE2+细胞用绿色荧光团染色。在C,通过用红色荧光团染色通过绿色荧光团染色上皮细胞,通过用红色荧光团染色来鉴定上皮细胞的空气暴露(上三面板)和CS暴露(下三个面板)鼠肺泡细胞。还示出了每个染色的染色同种型对照。在D,通过ELISA测量的ACE2蛋白水平在暴露于Cs的小鼠中,持续一个月与空气(n = 10-15 /组)降低。* =P < 0.05; ** = P < 0.01; *** = P< 0.001。CS香烟烟雾

体外CS暴露增加了Calu3和HBECs中的gamma H2AX水平,证实了CS在细胞中诱导氧化应激(附加文件1:图。S4)。在假处理细胞中未观察到相同的效果。此外,活力测定证实,用于在SARS-COV-2感染之前用于曝光的Cs浓度不致死细胞。

体外SARS-CoV-2感染Calu3细胞很容易通过dsRNA染色观察到(图。3.).在假处理的细胞中,vRNA的复制在48 h达到高峰,而cs暴露将感染消除到低于检测限的水平。在病毒N蛋白表达中也可以看到类似的结果,显示病毒蛋白合成在72小时达到高峰。在上清中检测不到ACE2蛋白水平,而在cs处理的细胞与假细胞裂解液中(未显示),ACE2蛋白水平没有变化。同样,SARS-CoV-2感染HBECs导致假处理细胞中vRNA复制在72 h达到高峰,而急性cs暴露从感染后48 h开始降低了感染(图)。4A).空斑实验证实了cs依赖的病毒复制抑制,感染后48 h和72 h传染性SARS-CoV-2的PFU水平均显著降低(图2)。4b)。

图3.
图3.

香烟烟雾(CS)提取块体外SARS-CoV的-2的Calu-3细胞中的复制。为了研究对SARS-COV2感染香烟烟雾(CS)曝光的影响,我们进行了在的Calu-3细胞中,线许可到SARS-COV2感染和复制的体外感染72小时。细胞假手术或24小时CSE处理。上清液(SN)和细胞质裂解物从细胞等分试样通过ELISA来测量ACE2水平获得。然后,细胞用SARS-CoV的-2(2小时病毒在正常媒体感染,然后取出接种物)。每24次小时将细胞固定为IF感染的染色,并收获用于SDS-PAGE和病毒核壳(N)蛋白的WB细胞裂解物。病毒RNA的(的vRNA)的复制过程中的dsRNA中间体出现,并且IF用dsRNA特异性单克隆J2抗体染色为SARS-CoV的-2复制的良好标志物。尼康TI2自动化显微镜被用于定量测量的感染,由双链RNA信号所见。而的vRNA复制达到峰值在48小时(A、 B)在假处理的细胞中,CSE治疗废除感染到低于检测限度的水平。对于病毒N蛋白的WB,观察到类似的结果,显示72小时的峰病毒蛋白合成(C).在C,免疫印迹显示两条用于密度测定的条带,用水平白线分开,一条用于N蛋白,一条用于GADPH。这两条带是从补充储存库中提供的原始凝胶中裁剪出来的。ACE2蛋白水平在SN中检测不到,但在CSE处理的细胞裂解物与假细胞裂解物中没有变化(未显示)。总之,在这个体外模型中,CSE预暴露增加了ACE2水平,但可能消除了SARS-CoV-2的复制。该图代表了三个独立的实验

图4.
图4.

急性Cs治疗嵌段在差异化原发性气道上皮的体外SARS-COV-2复制。在SARS-COV-2感染之前,通过在空气液体界面处通过培养物完全分化为气道上皮的HBECs,在SARS-COV-2感染之前进行急性假声或CS暴露。通过在37℃下用SARS-COV-2的SARS-COV-2在0.05pFu / Cell MOI下用SARS-COV-2感染细胞,洗涤以去除未结合的病毒,并将感染孵育24小时,48小时和72小时。一个采集样本进行RNA纯化和RT-qPCR,检测感染细胞中SARS-CoV-2核衣壳基因水平。cs处理后48 h和72 h的SARS-CoV-2 N基因水平较假处理细胞低(N = 3个技术重复)。* =P< 0.05。** = P< 0.01。CS香烟烟雾。B取感染的HBEC细胞,在transwell顶端加入200 uL新鲜培养基,收集从感染细胞释放的所有子代病毒。如方法部分所述,通过空斑试验滴注子代病毒的数量。在感染48和72 h后,cs处理的细胞比sham处理的细胞产生更少的SARS-CoV-2后代(n = 4)。* =P< 0.05。CS香烟烟雾

讨论

CS和COPD对SARS-COV-2感染和疾病的影响仍然是辩论问题。如果在全球范围内的一手流行病学研究表明,Covid-19患者中的活性吸烟者和COPD的患病率低于预期的[7891011121314]开发Covid-19的吸烟者更有可能更糟糕的Covid-19相关结果[38.39.]. 在此,我们表明,CS和COPD与人类和小鼠队列中较低的ACE2水平相关,并且CS预暴露可在体外模型中有效地消除SARS-CoV-2复制。2019冠状病毒疾病的研究结果表明,在最近的研究中发现,严重COVID-19型肺炎吸烟者的肺组织中ACE-2水平降低。40],但与其他一些国家不一致[1819202141.].张等人。[19]评估NS和吸烟者中的ACE2基因表达,发现ACE2表达在中央航空中更高。我们发现,始终如一地与他们和其他人的发现。张等人。在他们的分析中没有包括COPD患者,CAI等人。[18]史密斯等人[41.]分析了COPD和对照组大小气道上皮样本的基因表达数据集,得出长期吸烟是导致ACE2水平升高的主要因素;然而,COPD的影响在数据集上并不一致。梁等人[20]据报道,吸烟者肺组织ACE2蛋白和mRNA水平高于NS,COPD患者高于非COPD患者。此外,他们量化了亚段气道刷扫中的ACE2 mRNA水平,而我们评估了周围肺切除。Leung等人还发现,与对照组相比,COPD患者的细支气管上皮细胞ACE2染色呈弥漫性增加,而我们在细支气管细胞中检测到顶端染色,仅在杯状细胞和棒状细胞中呈弥漫性表达。雅各布斯等人[21]据报道,与NS相比,无COPD和有COPD的吸烟者的ACE2蛋白和mRNA水平更高。然而,在方法(例如,不同ACE2剪接变异体的引物)和研究人群(高血压患病率较高,口服皮质类固醇、LABA和LAMA治疗,均已知影响ACE2水平)方面存在一些差异[42.43.在我们的研究中,女性和现有吸烟者的比例要高得多。尽管如此,我们的研究对象在中央和周围气道中发现的ACE2表达的大小与其他研究中发现的一致[2144.45.46.].值得注意的是,可溶的ACE2可从上皮表面被释放到气道管腔通过脱落酶裂解[47.48.],并且因此,ACE2在气道的响应于有害刺激诸如CS和COPD动态表达可以在发现这样的背后变性。

CS-曝光小鼠在肺泡和支气管上皮细胞中的αce2+细胞减少,与空气暴露的小鼠相比,六个月的Cs暴露后发现的最低数量的ACE2 +细胞。先前的研究表明,与空气暴露的动物相比,在CS暴露大鼠的肺中显示出肺部肺部的肺部2mRNA表达[49.].与此相反,在最近的研究中,发现在高肺ACE2水平的CS暴露与空气中暴露的小鼠[41.,但暴露在烟雾中的时间比我们研究中使用的短,这可能导致较少的气道重塑和肺气肿。此外,在cs暴露的肺中表达ACE2的细胞亚型未被评估。

最后,我们首次表明CS在体外,CS-3和初级HBEC中的SARS-COV-2复制。吸烟和SARS-COV-2细胞系感染模型存在争议。已显示急性Cs暴露,以减少天生的免疫应答和气道基础干细胞增殖体外[50],并增加原发性支气管上皮培养中的ACE2水平,MACE2活性和SACE2 [51]. 然而,这些差异并不令人惊讶,因为来自不同供体的ALI培养物中的气道上皮细胞的分化能力存在很大差异,尤其是在CS刺激下,其本身可以根据产生方法引入高度的变异性,以及每组培养物中SARS-CoV-2感染细胞数量的变化。因此,评估异质患者样本的影响可能具有挑战性。此外,细胞感染SARS-CoV-2的时间非常关键,病毒载量最大的时间点并不一定与细胞类型的最大变化相对应。总之,2019冠状病毒疾病的2019冠状病毒疾病的发病率和COVID-19表达和发病率的亚适性指标与肺可归因的COVID-19肺发病率相混淆。其他因素可能在吸烟、COPD和SARS-CoV-2感染之间的相互作用中发挥作用。首先,在SARS-CoV-2感染期间,ACE2水平升高是有益还是有害尚不清楚。重要的是,Imai等人发表的一项关键研究[52显示ACE2对脓毒症致小鼠严重急性肺损伤有保护作用。此外,由于ACE2的表达从上呼吸道到肺部显著下降,我们推测对病毒的易感性应该主要与鼻黏膜和上呼吸道中ACE2的存在有关[53].其次,ACE2等位基因变异中自然发生的结构变化可能会干扰与SARS - CoV-2刺突蛋白的分子间相互作用,从而干扰病毒进入[54]. 第三,尼古丁通过下调ACE2和血管紧张素II受体的表达和/或活性,与多器官系统中肾素-血管紧张素系统的许多成分相互作用[24].此外,在支气管上皮细胞上丰富的烟碱乙酰胆碱受体的活化[55,可导致蛋白酶活性增强,裂解膜融合所需的SARS-CoV-2刺突蛋白,导致病毒进入宿主细胞受损。第四,可溶ACE2可通过脱落酶切割从上皮表面释放到气道[47.48.].可溶性ACE2释放是一种动态过程,两者都是组成型和响应各种刺激,可能的CS和COPD。

我们承认,这项研究的一个主要局限性是缺乏对CS介导SARS-CoV-2感染和疾病的机制的了解。尽管如此,我们相信我们的初步体外研究结果是非常新颖和惊人的,可以为未来旨在了解CS对SARS-CoV-2感染的影响的研究铺平道路。此外,我们对急性CS暴露的体外研究结果与我们对慢性CS反应中ACE2水平下降的体内观察结果并不相同。最后,我们承认其他可能的SARS-CoV-2受体/蛋白酶,如组织蛋白酶L、BSG、Adam17可能在SARS-CoV-2感染中发挥作用,目前正在进行分析。

结论

总之,我们报告了在两个独立的人类队列中,COPD患者与非COPD吸烟者和NS对照组相比,肺泡和细支气管上皮中ACE2的蛋白和mRNA水平较低。我们一致报道,长期暴露于CS环境的小鼠与暴露于空气环境的小鼠相比,ACE2水平降低。最后,我们报道了CS预暴露可有效地降低SARS-CoV-2体外模型的复制。这些结果表明,CS、COPD、ACE2和SARS-CoV-2进入宿主细胞之间存在复杂的生物相互作用,需要在未来的临床和转译研究中进一步探索。

可用性数据和材料

在合理的要求下,通讯作者将提供原始数据。

缩写

阿里:

空气液体界面

慢性阻塞性肺病:

慢性阻塞性肺疾病

新冠肺炎:

2019年冠状病毒病

CS:

香烟烟雾

黄金:

全球阻塞性肺病倡议

HBEC的:

人支气管上皮细胞

IC:

吸入皮质类固醇

拉巴:

长效的β激动剂

喇嘛:

长效的毒蕈碱拮抗剂

NS:

从未吸烟者

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下载参考

致谢

我们非常感谢Jen Uhrlaub对亚利桑那大学BSL3套件的帮助,以及dr。丁欣欣和韩卫国感谢他们在烟雾暴露方面的帮助,以及西南环境健康科学中心(SWEHSC)。

基金

哮喘和气道疾病研究中心(亚利桑那大学)为研究的设计和数据的收集、分析和解释提供了资金;计划生育得到了NIH/NHLBI (HL149744)、空乘医学研究所(#YFAC141004)和NIH/NHLBI (HL132523)的资助,这些资助支持了研究的设计、数据的收集、分析和解释;合成生物学得到了帕多瓦大学支持样本收集的基金的支持。SKC得到了UA RII COVID-19种子赠款(#002196)和NIGMS赠款(1R01GM136853)的支持,用于支持样本分析和数据分析;CAT得到了UA TRIF基金和NIDDK R00 DK103126的支持,支持样品分析。FDM得到NIH/NHLBI (HL139054, HL091889, HL132523, HL130045, HL098112, HL056177), NIH/NIEHS (ES006614), NIH/NIAID (AI126614)和NIH/主任办公室(OD023282)的资助,支持手稿的撰写。

作者信息

隶属关系

作者

贡献

MT、MC、SB、CAT、SKC、AP、FP构思了项目并设计了实验。MT, MC, JNM, SB, LS, CRC, DAB, SL, JAM, SK, SSK, JT, JRQ, JL, CAT, SKC和FP进行了实验和/或对数据分析和解释做出了贡献,并/或为研究收集了样本。MC、SB、MK、YT、FDM、CAT、FK、SKC、AP、FP参与了手稿的编写和编辑。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到F波尔韦里诺

道德宣言

伦理批准和同意参与

该研究符合《赫尔辛基宣言》,并得到了当地伦理委员会的批准(亚利桑那大学IRB #1811124026和费拉拉大学IRB #080399)。获得了每位受试者的知情书面同意。所有小鼠研究均由布里格姆和妇女医院(BWH) IACUC委员会批准,并按照BWH IACUC和ARRIVE指南进行。

同意出版

所有作者都同意发表这份手稿。

相互竞争的利益

M. conoli已获得Chiesi、阿斯利康、勃林格殷格翰、Alk-Abello、葛兰素史克、诺华、赞邦的个人费用,以及Chiesi和意大利费拉里大学的科学资助。A. Papi:董事会成员、顾问、讲座报酬、研究拨款、葛兰素史克、阿斯利康、Boehringer Ingelheim、Chiesi Farmaceutici、TEVA、Mundipharma、Zambon、诺华、Menarini、赛诺菲、罗氏、Edmondpharma、Fondazione Maugeri、Fondazione Chiesi差旅费用报销。其他的作者都没有相互竞争的利益冲突。

附加信息

出版商的注意

BOB体育网站施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

本文的预印刷品可在此处提供:https://www.biorxiv.org/31.12.07.413252v1

补充信息

附加文件1:图S1。

在COPD中央航空公司与吸烟者和NS对照中,在ACE2表达中没有发现任何差异。相比之下,COPD患者的外周气道与吸烟者和NS对照中的外周气道均表达较低。图。S2。从不吸烟者和COPD肺中ACE2的mRNA表达水平所使用的引物来自Blume C.等人。Nat,麝猫。2021。图S3。ACE2 mRNA表达与其蛋白质水平在所有分析的受试者(COPD,吸烟者和NS对照中)通过ELISA(P = 0.01和R = 0.71)测量的蛋白质水平之间的显着相关性。图。S4。体外CS暴露增加人支气管上皮细胞(HBEC)中γH2AX的水平,证实CS在细胞中诱导氧化应激。

权利和权限

开放存取本文根据创意公约归因于4.0国际许可证,这允许在任何中或格式中使用,共享,适应,分发和复制,只要您向原始作者和来源提供适当的信贷,提供了一个链接到Creative Commons许可证,并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明,否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中,除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中,法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用,您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本,请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. 知识共享公共领域奉献豁免(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据,除非在数据的信贷额度中另有说明。

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汤姆切尼,M.,康托利,M.,梅奥,J。等等。吸烟和慢性阻塞性肺病对SARS-CoV-2感染和疾病的矛盾影响。BMC PURM MED.21,275(2021)。https://doi.org/10.1186/s12890-021-01639-8

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